我国周朝时就已能生产酱油。古代生产酱油的方法比较原始，是把大豆煮熟，使其自然发酵，加盐就制成酱油。而日本最早的酱油是以鱼类作原料的，把鱼放在土缸里，用盐腌制，自然产生出一种带香味的液体，可作为调味汁使用，这是因为鱼的蛋白质经过自然反应，转化为氨基酸，因而产生了一种鲜味。
起初，做酱油和做酱很难区分开。农村做酱是用大豆面和玉米面等作原料，把大豆炒熟磨碎，加水和玉米面揉和成团，放在阴凉处“发毛”，干了以后再捣碎，加盐、加水，放在缸中继续发酵。起初，人们对豆酱和酱油的性质并不了解，后来发现豆酱放久了，表面会渗出一层汁，而这种汁便是最原始的酱油。
《齐民要术》中详细记载了豆酱、肉酱和鱼酱的制作方法，还把制酱用的曲与酒曲相区分，称之为“黄衣、黄蒸”。黄衣是用整粒小麦做的曲，黄蒸是用麦粉做的曲。由于酒曲和酱曲要求不一样，制曲控制的条件也不同，从而获得性质不同的微生物。这说明1500多年前，我国劳动人民已经会利用黄曲霉和曲霉一类的微生物了。发酵生产酱油一般需要一年以上的时间，由于酱油的需求量日益增长，解决酱油的快速制作问题便摆在了人们面前。1919年，日本的梅野明二郎发明了用10天时间制造酱油的方法。这种方法是：首先把大豆制成曲，在缸内加盐、加水，和匀，在40℃到60℃高温下，使蛋白质快速分解成氨基酸。此法生产的酱油味道与一般酱油没有区别，后经过进一步改进，这项发现才应用于酱油生产。
1924年，日本人玉静又发明一种生产酱油的新方法，该方法是把大豆制成糟，加入强碱，使蛋白质分解为氨基酸，再加入酱油酵母和小麦曲使其发酵，此法生产的酱油风味独特。受这个发明的启示，人们又发明了一些不用大豆蛋白质生产酱油的方法，如利用已提取鱼油的鱼渣、已提取酱油的酱油渣等原料，使这些蛋白质分解成氨基酸，制成代用酱油，再掺入真正的酱油中使用。
今天我们已经知道，生产酱油离不开微生物的作用，通过曲霉菌在原料上的大量繁殖，得到制酱油所需要的各种酶，主要是蛋白酶和淀粉酶。发酵是酱油生产中的重要工艺过程，它对酱油的质量和原料的利用率都有极大影响，制曲过程中介入了曲霉菌，而从空气中落入的酵母菌和细菌，在发酵中也起到了作用。可见，发酵是曲霉菌、酵母菌和细菌等多种微生物联合反应的结果。
