（一）固定化方法
1.吸附法
用水不溶性载体（如多孔玻璃、活性炭、氧化铝、硅胶磷酸钙、淀粉、金属氧化物等）将酶吸附于其表面的一种固定化方法。物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少等优点，但一般吸附力较弱，酶容易脱落。
2.结合法
酶通过离子键、共价键结合于水不溶性载体的固定化方法。通过离子键和离子交换剂结合，该方法操作简单、处理条件温和、酶的高级结构和活性中心的氨基酸不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。
共价结合法是载体结合法中报道最多的方法。该法的优点是酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。所用载体分为三类：天然有机载体（如多糖、蛋白质、细胞）、无机物（玻璃、陶瓷等）和合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）。
3.交联法
用双功能或多功能试剂使酶分子之间交联的固定化方法。此法也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。作为交联剂的有戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺等。
4.包埋法
包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高。
将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中，载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物以及淀粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉莱胶等天然高分子化合物。
将酶或微生物包埋在高分子半透膜中，通常形成直径为几微米到几百微米的球状体，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。
（二）固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优点：
（1）酶的稳定性增加，减少温度、pH值、有机溶剂和其他外界因素对酶的活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。（2）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。（3）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。
固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。
1.在工业上的应用
经过近20年的发展和完善，1969年，日本的千烟一郎首次将固定化氨基酰化酶用于生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用的新局面。此后，葡萄糖异构酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、延胡索酸酶、b-半乳糖苷酶、天门冬氨酸-b-脱羧酶等多种酶先后用于工业化生产。
（1）氨基酰化酶
这是世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将氨基酰化酶与DEAE-葡聚糖凝胶通过离子键结合法制成了固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60％左右。
（2）葡萄糖异构酶
这是世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶的放线菌细胞用60～65℃热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化成果糖，用于连续生产果葡糖浆。
2.在医学上的应用
（1）固定化纤溶酶消血栓
近年来出现的纤溶酶药物注射到血栓病人身上能使堵塞毛细血管的血纤维蛋白溶解，缓解或消除血栓症状。但纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。另外，酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。
（2）人工肾
肾衰竭病人会因为肾功能的彻底丧失无法排除尿素等代谢废物而得尿毒症。用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾有望给肾衰竭病人带来福音，人工肾中的脲酶将病人血液中的尿素水解成氨，再用活性炭吸附，从而消除尿毒症状。
3.在分析检测中的应用
（1）葡萄糖传感器和血糖测定仪
1967年，Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器——葡萄糖氧化酶电极。
葡萄糖氧化酶可催化钡-D-葡萄糖和氧气反应生成D-葡萄糖酸-1，5-内酯和水，根据反应中消耗的氧气、生成的葡萄糖酸和水的量，可以用氧电极、pH电极和水电极来测定葡萄糖的含量。
酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成，固定化酶膜选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应；变换器把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。
用葡萄糖氧化酶制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。
（2）水质监测酶传感器
酶传感器还可用于水质监测。如用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成的酚传感器，可检测大多数酚类化合物。
（3）鱼鲜度传感器
鱼鲜度传感器在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内ATP经酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用K值表示：
K=肌苷+次黄嘌呤/ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷+次黄嘌呤+尿酸
大多数鱼死后5~20小时，ATP，ADP和AMP已分解尽，超过24小时，鲜度主要取决于IMP-肌苷-次黄嘌呤-尿酸。将这三个步骤的三种酶（5′-核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。
当K<；20时，鱼极新鲜，可供生食。
K在20~40之间为新鲜，必须熟食。
K大于40，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。
（4）肉鲜度传感器
肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。
用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感器，或用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。
4.在废水处理方面的应用
此外，固定化酶还可以用在废水处理方面，进行废水的连续处理。
第四节 酶的应用
酶作为一种催化剂，已广泛地应用于工业、农业、医药、环保及科研等领域。近几十年来，随着酶工程的迅猛发展，酶在生物工程、生物传感器、环保、医药等方面的应用也日益扩大，可以说酶已成为国民经济中不可缺少的一部分，现实生活中，人们的衣、食、住、行及其他方面的新技术几乎都离不开酶。酶分子修饰，酶和细胞固定化等酶工程技本的发展，使酶的应用显示出更加广阔美好的前景。
一、酶在医药方面的应用
随着对疾病发生的分子机制的深入了解，医药用酶的应用范围越来越广泛。酶在医药领域主要是用于疾病的诊断、治疗和制造药物。
（一）疾病诊断方面的应用
疾病治疗效果的好坏，在很大程度上取决于诊断的准确性。疾病诊断的方法很多，其中酶学诊断发展迅速。由于酶催化的高效性和特异性，酶学诊断方法具有可靠、简便、快捷的特点，在临床诊断中已被广泛应用。
酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病；二是利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。
1.根据体液内酶活力的变化诊断疾病
一般健康人体液内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。当人体某些器官和组织受损或发生疾病后，某些酶被释放入血、尿或体液内。如急性胰腺炎时，血清和尿中淀粉酶活性显著升高；肝炎和其他原因肝脏受损，肝细胞坏死或通透性增强，大量转氨酶释放入血，使血清转氨酶升高；心肌梗塞时，血清乳酸脱氢酶和磷酸肌酸激酶明显升高。许多中毒性疾病几乎都是由于某些酶被抑制所引起的。因此，借助血、尿或体液内酶的活性测定，可以了解或判定某些疾病的发生和发展。
【知识拓展】
有机磷农药和重金属离子的中毒机理
如常用的有机磷农药（如敌百虫、敌敌畏、1059以及乐果等）中毒时，就是因它们与胆碱酯酶活性中心必需基团丝氨酸上的一个-OH结合而使酶失去活性。胆碱酯酶能催化乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，当胆碱酯酶被抑制失活后，乙酰胆碱水解作用受抑，造成乙酰胆碱堆积，出现一系列中毒症状，如肌肉震颤、瞳孔缩小、多汗、心跳减慢等。当有机磷农药中毒时，胆碱酯酶活性受抑制，血清胆碱酯酶活性下降；某些金属离子引起人体中毒，则是因为金属离子（如Hg2+）可与某些酶活性中心的必需基团（如半胱氨酸的-SH）结合而使酶失去活性。
123452.用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量从而诊断某些疾病。例如：利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的联合作用，检测血液或尿液中葡萄糖的含量，从而作为糖尿病临床诊断的依据，这两种酶都可以固定化后制成酶试纸或酶电极，可十分方便地用于临床检测。
（二）疾病治疗方面的应用
近年来，酶疗法已逐渐被人们所认识，广泛受到重视，各种酶制剂在临床上的应用越来越普遍。
蛋白酶可用于治疗多种疾病，是临床上使用最早、用途最广的药用酶之一。蛋白酶（多酶片的主要成分）在医药领域的应用最初是在消化药上，用于治疗消化不良和食欲不振。胰蛋白酶、糜蛋白酶等，能催化蛋白质分解，此原理已用于外科扩创，化脓伤口净化及胸、腹腔浆膜粘连的治疗等，去除坏死组织，抑制污染微生物的繁殖。
溶菌酶破坏革兰氏阳性菌细胞壁而杀死细菌，用于治疗手术性出血、咯血、鼻出血，分解脓液，消炎镇痛，治疗外伤性浮肿，增强放射线治疗的效果等。
L-天冬酰胺酶是第一种用于治疗白血病的酶。因为癌细胞生长时需要天冬酰氨，L-天冬酰胺酶可以切断天冬酰胺的供给，因此对癌症，特别是白血病的治疗有显著疗效。
此外，在血栓性静脉炎、心肌梗塞、肺梗塞以及弥漫性血管内凝血等病的治疗中，可应用纤溶酶、链激酶、尿激酶等，以溶解血块，防止血栓的形成。
（三）在药物生产方面的应用
酶在药物制造方面的应用是利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方面的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的。
如某种抗生素使用时间久了，病原菌就会产生相应的耐药性，对药物反应降低、产生抵抗性能。青霉素酰化酶可将易形成抗药性的青霉素改造成杀菌力更强的氨苄青霉素等半合成抗生素。
如β-酪氨酸酶可催化L-酪氨酸或邻苯二酚生成二羟苯丙氨酸（多巴）。多巴是治疗帕金森综合征（一种神经性疾病，主要症状为手指颤抖，肌肉僵直，行动不便）的一种重要药物。
又如人胰岛素与猪胰岛素只有在B链第30位的氨基酸不同。无色杆菌蛋白酶可以特异性地水解除去胰岛素B链第30位的丙氨酸，然后使之与苏氨酸丁脂偶联，然后用三氟乙酸和苯甲醚除去丁醇，即得到人胰岛素。
2【知识拓展】
抗生素耐药之危
中国药学会抗生素专业委员会委员、解放军总医院临床药理药学研究室主任王睿说：“抗生素在我国各医院的应用病例、处方量、用药金额都是第一位的。我国住院患者50％以上都用过抗生素，而国外只有30％；我国患者使用抗生素的花费达到用药经营的30％以上，而国外在15％到30％之间。目前，我国临床使用抗生素有1/4左右为不合理使用。滥用抗生素除了损害人体器官、导致二重感染、浪费医药资源外，最重要、最值得关注的是诱发细菌的耐药性。”
耐药性又称抗药性，一般指长期应用抗菌药使病原体对药物反应降低、产生抵抗性能的一种状态。创新的抗生素药研制周期一般是10年，而耐药菌在抗生素使用后一个月就能产生，其速度远远快于新药的开发速度。现在，耐药菌引起的严重感染是临床非常棘手的问题，尤其是在重症监护病房，许多患者死于多重耐药菌感染。
