这一天，林肯的日程表一如往常，安排得满满的——上午8点前办公，然后进早餐，11点内阁开会前接见来访者；午餐，会客；傍晚陪同夫人玛丽·托德乘马车兜风，同老乡旧友作非正式晤谈；整天去陆军部一两次，再次会客；稍晚，同玛丽·托德及几名随从去剧院。
早在之前，陆军部长斯坦顿和哥伦比亚特区警察局局长沃德·希尔·拉蒙等人就经常告诫过林肯要注意自身的安全，不过林肯对他们的劝告基本上都是一笑置之。在总统办公室的一个档案袋里，装着一个注明“暗杀”字样的大信封，里面全是收集所接获的给林肯的恐吓信。截至1865年3月底，装在这个信封里的恐吓信就有80封之多。林肯曾经对国务卿西华德说道：“我知道我处在危险之中，但我不想把这种恐怖放在心上。”
根据林肯的警卫员克鲁克在事后的回忆，当天傍晚，林肯步行来到陆军部的时候，似乎已经预感到了即将到来的危险。那天林肯有些反常，竟然笑着对克鲁克说：“克鲁克，我相信有人想要谋杀我，你知道吗？”稍停片刻，他又自顾自地嘟嘟囔囔：“我毫不怀疑，他们会这么干的。”而在平时，每当别人提醒总统可能有人要加害于他时，他总是一笑置之，或答应要慎加防范而已。而且当他和林肯谈到计划晚上去看戏的事时，林肯语出无奈地应道：“我们去那里的事既然都登出了广告，我不能让人失望。要不然我是不去的。我不愿意去。”
当时陪同林肯夫妇乘马车前往华盛顿E街和F街之间第十街上的福特剧院看戏的，有陆军部和斯坦顿特意派来的志愿兵少校亨利·里德·拉思伯恩和他的未婚妻，还有一位从首都警察部队选派来白宫担任总统保卫工作的四名军官之一，他是约翰·帕克，他的任务是寸步不离总统，严密监视可能加害总统的任何一个嫌疑犯。
然而，这个约翰·帕克不仅没有在整个演出过程中恪尽职守，保卫着总统的安全，而且擅自下楼到街上和几个相好的同伙喝酒去了。这样，就给那个潜伏的刺客提供了作案良机。事后查明，正是这个保卫军官约翰·帕克有些可疑的经历。
晚上9点，林肯一行进入福特剧院，随即被带进包厢。池座和楼座的近千名观众看见或听说总统到来，便齐声鼓掌欢迎。不少人还起立欢呼，林肯也停步驻足，向欢迎的人群挥手致意。当天晚上，剧院演出的是英国剧作家托姆·泰勒14年前的剧本《我们的美国亲戚》。
在演出换幕的间歇，警卫帕克离开了包厢的岗位，到大厅里喝咖啡去了，这种不该出现的失误给布斯暗杀林肯提供了大好机会。戏还在继续演，下一幕正进入高潮。
９点45分，布斯偷偷摸摸地窜进小门，又迅速掩上门，把一根结实的细木棍插入砖墙上事先挖好的两英寸深的洞眼，把门顶个结实严紧。接着，他又蹑手蹑脚地穿过狭窄的甬道，有恃无恐地扑到后门，从事先用手钻钻出的小孔中窥视林肯坐在包厢内的位置，然后蹑手蹑脚地伏在包厢外面，从腰间拔出那支铜制单发左轮小手枪。
大约10点左右，布斯非常平静地走进了总统的包厢。而这时，舞台上的喜剧正演到激烈的地方，所有人的注意力都集中在了舞台之上，没有注意到总统包厢之中已经悄悄地多出来了一个人。在进入包厢之后，布斯用一段木头撑住了包厢的大门，以免有人误闯进来。
在等待了一段时间之后，终于等到了第三幕中他熟知的一段，一段观众笑声最响的时候。就在林肯总统与随行人员全神贯注的看戏的之时，布斯悄悄地把手枪对准了林肯的左耳朵和背脊之间。只听见“呯”的一声，一颗直径不足半英寸的铅弹头射向林肯的左侧头颅，从距左耳3英寸的齐耳高处穿入后脑壳。子弹斜着穿过大脑射向右眼，最后嵌入右眼眶之后几英寸的致命处。布斯一共开枪八次，林肯被击中了六枪，其中五枪击中了林肯的要害部位。
在场一共有一千六百多名观众，只有很少的人听见了枪声，甚至坐在林肯总统旁边的人，也丝毫没有被枪声吓住，因为布斯有意选择了戏剧的高潮部分，在所有观众都情绪激动，欢呼升起的时候，布斯选择了开枪。
这一切来得太过突然，接下来包厢里一片混乱，布斯甚至从包厢里跳到舞台上，转身向观众喊了句：“一切暴君都是这个下场。”这是弗吉尼亚州的名言。这宣告他为南方奴隶主复仇成功。
全场观众惊呆了，所有人都处在茫然无措的状态，甚至没有人记得去追捕布斯。只用了短短几分钟，布斯就从剧院中逃走了。
少校拉思伯恩抓不到刺客，立即跑回包厢里，看见林肯把头枕在夫人玛丽的膝盖上，闭着眼睛，脸色苍白，一动不动。引座员莉丽沙带着一个留着络腮胡子、样子约２５岁的年轻人走进包厢，他就是合众国志愿兵外科医生查尔斯·利拉尔。利拉尔医生在少校亨利和总统夫人玛丽的帮助下，把林肯平放在包厢的地板上。
利拉尔医生抬起林肯的头部，在头发中仔细地摸着，发现林肯有脑损伤的迹象。利拉尔医生弯下身来，把两个指头伸进林肯的喉咙，压迫舌根部，并用手指清除喉咙部位积存的血迹和分泌物，设法启动林肯的呼吸器官，以刺激呼吸系统。
一会儿，医生查尔斯·萨宾·塔特夫从戏院的另一侧跑过来，利拉尔医生请塔特夫医生摇动林肯的两只手臂，自己则按压住林肯的胸部隔膜，以促进他的心脏跳动。经过一番抢救之后，林肯的脉搏由原来的不规律逐渐转为正常。
利拉尔医生认为，林肯的伤势很重，而且是致命伤，要立即送往医院抢救，于是少校拉思伯恩迅速找来一辆马车和利拉尔医生、塔特夫医生以及总统夫人玛丽一起将林肯送往附近的霍华得大学医院急诊部。医生们给林肯脱去衣服，从头到脚检查了一遍，只发现他头部的枪伤。林肯全身冰凉，双腿不停地抽搐着。
主任医生韦尔斯·乔治叫护理人员拿来热水和毛毯给林肯盖上，又要了一支芥末膏涂在林肯的太阳穴和整个身体上。林肯的呼吸渐渐困难，脉搏每分钟只跳动40次，而且很微弱，左眼瞳孔收缩得非常厉害，右眼瞳孔扩大，生命危急。
在医院的另一间房里，总统夫人玛丽由4个妇女陪着，玛丽３次被通知见林肯最后一面，其中第二次，玛丽哭着对林肯说：“您一定要活下去，您必须要活下去，您的心愿还没有完成啊！”
4月15日凌晨２点左右，主任医生乔治试图找出那颗子弹。过了一个小时，医生们认为，即使找出这颗子弹，林肯也活不下去了。
凌晨５点，在总统林肯的病房里，曙光从窗外射了进来，灰白色的光线使病房里的煤气灯的黄色火焰显得黯然失色。林肯眼看就不行了。清晨６点，主任医生乔治从病房里走出来，只见病房外每隔３米就聚集着一堆人，其中一些市民已站在那里守候了整整一夜。
人们向乔治探询总统林肯的情况，乔治回答说：“总统林肯很快就不行了。”人们的脸上顿时都露出了极大的悲哀，特别是那些黑人们，完全被悲痛所淹没了。他们痛哭，痛哭他们失去了解放的机会。
7点整，主任医生乔治走进病房。林肯的体温在变凉，他的长子罗伯特·林肯抑制不住悲伤，转过头去倚在参议会议长萨姆纳·乔治的肩上，大声恸哭起来。死神终于毫不留情地带走了总统林肯。林肯的最后一次呼吸是在1865年4月15日上午7点21分55秒，最后一次心脏跳动是在7点22分10秒，接着主任医生乔治宣布总统林肯死去。
政府官员立即着手筹办林肯的葬礼，他们征求林肯夫人的意见。玛丽起初选择了芝加哥，因为他们原本就曾打算等林肯卸任后，搬到芝加哥去居住。但后来改变主意，表示希望把林肯葬在华盛顿的国会大厦，那里有一个为美国第一任总统乔治·华盛顿建的墓地，但从来没用过。
最后，玛丽忽然想起，林肯生前，他们两人曾到过一个乡间墓园，林肯当时说过，“我死后，把我葬在这样一个清静的地方。”因此，她选择伊利诺伊老家斯普林菲尔德郊外一个安静、美丽的墓园，作为林肯最终安息之所。
林肯遇刺身亡后连续数日，遗体一直被安放在白宫东厅里，全天对公众开放。随后，林肯的遗体被运往国会大厦，同样对外开放，让民众吊唁。最终，林肯的遗体被放在一列专车上，运往伊利诺伊。
从首都华盛顿到1700英里外的斯林菲德州，沿途的铁路两旁各站，站满了成千上万悲痛的人们，他们默默地站在那里，眼里含着泪水，看着火车缓缓驶过。田里干活的人看到火车经过，纷纷跪下祷告，送别领导他们走过四年血腥内战的国父林肯。
全国各地的教堂也都举行悼念仪式，牧师告诉信徒们说，上帝把林肯带走，是因为他已经完成了上帝授予他的使命，他已经把和平带给了联邦，把自由带给了所有人。
最后一次悼念仪式在斯普林菲尔德郊外的墓园举行，并以林肯第二次宣誓就职的话结束。林肯当时曾说，“让我们按照上帝指引的正确方向，不带对任何人的恶意、带着对所有人的善心，秉持对正义的坚定，努力完成眼前的工作。让我们治愈国家的伤口。让我们竭尽全力，在我们中间和所有国家间实现并保持公正、持久的和平。”
1865年4月16日晚上10点，副总统安德鲁·约翰逊在华盛顿国会山庄宣誓任美国第17任总统。宣誓就职后，总统约翰逊任命联邦大法官约翰·Ｃ·布雷肯里奇成立联邦调查委员会，侦查总统林肯被暗杀事件。
另一方面，布斯成功刺杀林肯并逃离剧院后，和他的同伙赫罗尔德在之前计划的地点会和。随后，两人开始逃亡。他们出逃的第一夜住在一个小酒馆，接着又去了塞缪尔·穆德医生的家里，早先时候他们也把他列入了绑架计划。
穆德医生治疗了布斯的腿伤，但后来发觉了他们所做的事情，由于非常害怕成为他们的同犯，就送他们继续上路。后来一个叫托马斯·琼斯的联邦老兵让他们在松林里藏了5天，等着追捕风声一过，再企图尽可能地进入弗吉尼亚。
4月20日，布斯找来了一只船。4月22日，他们终于成功地渡河逃到了弗吉尼亚，并继续向南方潜行，后来他们到达了理查德·加勒特农场。过了波托马可河之后，两人发现自己明显受到了冷遇，在从战场上归来的联邦军人家中更是如此。最后他们将自己的命运交给了加勒特一家，加勒特一家让二人待了一个晚上，然后将他们送到一个烟草仓库。
与此同时，布雷肯里奇大法官领导下的调查委员会也缓缓拉开了大网，开始在各地搜捕缉拿凶手。而负责主要缉拿凶手的联邦侦探和纽约第16骑兵队也开始顺着蛛丝马迹一点点地摸到了加勒特农场。
这位骑兵队长回忆当时的情况如下——
我下了马，用力敲着前门，老加勒特出来了，我揪住他，问前几天被骑兵队跟踪的那两个逃犯在哪里。正当我问话时，突然，一个士兵大叫，“噢，中尉，这里有一个人躲在玉米仓库里。”但是我们发现是老加勒特的儿子，不是布斯及其党徒。我们审讯了这个小伙子，他很快告诉我，“谷仓里有人。”在留下一部分人看住房子后，我们包围了谷仓。我用力踢了踢谷仓的门，但是没有任何反应。我从加勒特的另一个儿子手中拿到了谷仓钥匙并打开了门，我要求里面的人出来投降。
拖延了一下后，布斯在里面回话了：“你们是不是搞错了？”
我回答：“那并不重要，你出来便是。”
他说：“我腿瘸了，而且只是一个人。”
我说：“我知道谁和你在一起，你们最好投降。”
他回答：“我只要朋友扶我出来，而不是我的敌人来扶。”
我说：“如果你再不出来，我就放火了。”一个下士立即堆好了一些干草靠在墙边并且点燃了火堆。
就在下士点火时，布斯在里面说：“如果你敢进来，我就用子弹打穿你的身体。”
我下令停止放火，并决定等到天亮后再进入谷仓制服他们。
又过了一会儿，布斯有气无力地说：“噢，中尉先生，这儿有一个人想向邪恶势力投降。”
我回答：“你最好出来。”
他回答说：“不，我还没有作出决定；但是请你的部下退后50步，给我一条生路。”
我告诉他，我有50个兄弟等在外面，一定要捉拿他。
他说：“好吧，我勇敢的兄弟，准备一个担架。”
这时，赫罗尔德走到门边，我要他交出枪械，布斯搭腔了：“枪全在我这里，是用来对付你们的，先生。”
我告诉赫罗尔德，“让我们看看你的手。”
他把门打开了一半，我们立即抓住了他的手腕。就在这时，我听见里面一声枪响，我想是不是布斯自杀了，推开门，我发现布斯身后的干草和麦秸已经着火了。
布斯有一根拐杖，手上还有一支卡宾枪。我冲进着火的谷仓，其他人也纷纷跟进来。我们把布斯夹在腋窝下很快脱离了谷仓。火势越来越大，我把布斯送到了加勒特家中。
布斯的后脑中了致命的一枪。原来，在赫罗尔德准备出来的时候，一个侦探走到了谷仓后面点燃了稻草。就着火光布斯看见了我，于是他用枪瞄准了我。危急时刻，一个士兵迅速向布斯开火了，本来这个士兵是想打中布斯的胳膊的，但是因为布斯一转身，子弹偏了，打在了布斯的后脑上。
布斯示意我抬起他的手，我抬起后，他喘着粗气说：“没用了，没用了！”我给他一点白兰地和水，但是他已经不能吞咽了，我立即派人去请外科医生，当医生到来时已是回天乏术。7点钟的时候，布斯咽下了最后一口气。他的身旁有一本日记、一把猎刀、两支手枪、一只指南针以及一张关于加拿大的草图。
